PCR pro Mycobacterium tuberculosis: vlastnosti postupu

Za účelem zefektivnění laboratorní diagnostiky, standardizace používaných metod a zajištění kvality mikrobiologických studií při detekci, diagnostice a léčbě tuberkulózy se v Ruské federaci zavádí jednotný systém provádění laboratorních studií, který zahrnuje tři etapy:

1) Primární vyšetření diagnostického materiálu v ústavech primární péče a v protituberkulózních ústavech. Účelem této fáze je určit přítomnost/nepřítomnost acidorezistentních mykobakterií ve sputu nebo jiném diagnostickém materiálu pomocí přímé mikroskopie u jedinců s podezřením na tuberkulózu na základě klinických a/nebo radiologických příznaků. V této fázi je identifikována epidemicky nejnebezpečnější kategorie pacientů.

Rozhodnutím místních zdravotnických úřadů, s přihlédnutím ke geografickým rysům, hustotě obyvatelstva, dopravním možnostem a dalším socioekonomickým faktorům, mohou být mikroskopické studie prováděny centrálně na základě laboratoří centrálních okresních nemocnic. V tomto případě je nutné zajistit organizaci pravidelného a včasného dodávání diagnostického materiálu z připojených institucí a také zajistit odpovídající organizaci míst pro odběr diagnostického materiálu v souladu s nezbytnými hygienickými a epidemiologickými normami. Centralizace výzkumu usnadňuje lepší řízení kontroly kvality provádění výzkumu.

2) Diagnostika komplexu mycobacterium tuberculosis pomocí kultivačních metod v antituberkulózních ústavech. V této fázi se provádí ověření pozitivních nebo sporných výsledků primárního laboratorního testu a diagnostika případů tuberkulózy s negativními výsledky primárního testu diagnostického materiálu pomocí mikroskopických metod. Tuto fázi zajišťují bakteriologické laboratoře protituberkulózních ústavů.

3) Stanovení lékové rezistence k antituberkulotikům a identifikace izolovaného patogenu v bakteriologických laboratořích protituberkulózních ústavů (úrovně II – IV) jsou složité a nákladné studie, které vyžadují vhodné laboratorní vybavení a vyškolený personál.

Bakteriologické laboratoře protituberkulózních pracovišť jsou odpovědné za organizační a metodickou pomoc klinické laboratoři všeobecného zdravotnického zařízení, školení jejího personálu a externí kontrolu kvality mikroskopických studií prováděných klinickou laboratoří přezkoumáním některých preparátů.

Laboratoře, které mají zvláštní povolení v souladu s federálními hygienickými předpisy, předpisy a hygienickými normami, mohou pracovat s materiálem infikovaným tuberkulózou a netuberkulózními mykobakteriemi (skupiny III – IV).

Bakterioskopické vyšetření je první, nejrychlejší, nejjednodušší a nejlevnější metoda k průkazu acidorezistentních mykobakterií. Metoda však ani při použití nejmodernější mikroskopické technologie (luminiscenční) neumožňuje detekci mykobakterií při jejich obsahu menším než 5000 10000 – 1 XNUMX mikrobiálních tělísek v XNUMX ml materiálu. Toto množství mykobakterií ve sputu koreluje s pokročilými progresivními formami procesu, přičemž v počáteční fázi onemocnění je množství mykobakterií vylučovaných pacienty pod detekčním limitem této metody.

Mikroskopická detekce acidorezistentních mykobakterií neumožňuje odlišit mykobakteria komplexu Mycobacterium tuberculosis (původci tuberkulózy) od netuberkulózních („atypických“) a saprofytických mykobakterií.

Kultivační metoda detekce mykobakterií umožňuje detekci mykobakterií tuberkulózy v přítomnosti několika desítek životaschopných jedinců patogenu ve studovaném patologickém materiálu. To je důležité zejména při studiu paucibacilárního diagnostického materiálu od nově diagnostikovaných nebo již léčených pacientů, kteří vylučují malé množství mykobakterií.

Ve věcech diagnostiky a léčby tuberkulózních pacientů musí bakteriologické laboratoře protituberkulózních ústavů zajistit řešení následujících úkolů:

— potvrdit tuberkulózní povahu onemocnění;

— určit taxonomickou příslušnost patogenu;

– určit jeho citlivost na léky;

— zavést systém interní a externí kontroly kvality laboratorních studií;

— provádět personalizovanou registraci pacientů s tuberkulózou a sledovat stav mykobakteriální populace;

— provádět spolu s ošetřujícími lékaři interpretaci údajů z mikrobiologického výzkumu.

Při stanovení klinické diagnózy a hodnocení účinnosti léčby pacienta je třeba vzít v úvahu výsledky mikroskopických a kulturálních studií, včetně mikroskopického vyšetření nátěru sedimentu diagnostického materiálu, izolace patogenu (kultury), diferenciace izolované kultury a stanovení její citlivosti na léčivo. Jako alternativní metody ke klasickému kulturnímu výzkumu je možné využít automatizované a poloautomatizované systémy akcelerované kulturní diagnostiky založené na použití tekutých živných médií a různých metod indikace růstu mykobakterií.

Pro účely rychlé identifikace mykobakterií tuberkulózního komplexu je jako doplňkové metody povoleno použití metod založených na amplifikaci fragmentů mykobakteriálního genomu (polymerázová řetězová reakce – PCR) a dalších molekulárně genetických metod. PCR analýzu lze použít k vyšetření sputa, bronchiálních výplachů, moči a mozkomíšního moku, stejně jako mikrobiálních kultur. Technologie provádění PCR je uvedena v popisech a návodech k použití příslušných souprav (testovacích systémů). Laboratoře používající takové metody musí být navrženy tak, aby se zabránilo křížové kontaminaci vzorků.

Algoritmus vstupního laboratorního vyšetření je popsán v přílohách č. 10 a č. 11 této vyhlášky. Jednotné metody a účetní a výkaznické formy používají léčebná a preventivní zařízení bez ohledu na resortní příslušnost.

Frekvence a načasování mikrobiologických studií během léčby a pozorování různých skupin pacientů jsou definovány v pokynech pro chemoterapii pacientů s tuberkulózou a pro organizaci dispenzárního pozorování a evidenci kontingentů protituberkulózních ústavů.

Tuberkulóza (do 19. století „konzum“) je jednou z nejčastějších společensky významných infekčních chorob způsobených různými druhy mykobakterií. Mycobacterium tuberculosis (Koch bacillus) je nejčastějším původcem plicní tuberkulózy. Tuberkulóza však může postihnout i jiné orgány, podle toho, kde se infekce do těla dostane.

Mykobakterie jsou kyselinovzdorné mikroorganismy ve formě tyčinek (bacilů), které jsou vysoce patogenní a zůstávají v prostředí dlouhodobě životaschopné. Po vstupu do těla zůstávají bacily jako zdroj infekce po celý život. Patogen se přenáší vzdušnými kapénkami z osoby s „otevřenou“ formou onemocnění na zdravého člověka při kašli, kýchání a/nebo mluvení. Mikroorganismus se také může dostat alimentární cestou s potravou nebo méně často kontaktem. Infekce ne vždy způsobí aktivní infekci. Často je člověk po infekci asymptomatickým nosičem mykobakterií a teprve při poklesu imunity se infekce aktivuje.

Předpokládá se, že v Rusku je nakaženo asi 80 % lidí. Navíc se během života přibližně u 10 % z nich infekce projeví formou aktivního infekčního procesu. Tuberkulóza je důležitým společenským problémem, protože více než polovina obětí této nemoci jsou lidé v produktivním věku a samotná nemoc vyžaduje zvýšenou kontrolu ze strany státu.

Vzhledem k tak vysokému výskytu mezi populací u nás bylo 3-7 dní po narození zavedeno očkování bacilem Calmette-Guérin (BCG). BCG vakcína je živý oslabený (atenuovaný) bacil Mycobacterium bovis, který může způsobit onemocnění skotu (bacil tuberkulózy skotu). Pro člověka nepředstavuje nebezpečí, protože ve vztahu k němu ztratil svou virulenci. Po intradermální injekci vakcíny do lidského těla je vyvinuta protituberkulózní imunita. Očkování však není schopno ochránit člověka před vstupem infekčního agens do organismu a zcela zabránit rozvoji onemocnění. Navzdory tomu imunita po očkování pomáhá předcházet rozvoji generalizovaných forem infekce a poskytuje celkové snížení morbidity a mortality.

Skupiny ohrožené rozvojem infekce.

Lidé s oslabeným imunitním systémem jsou nejvíce náchylní k infekci a rozvoji infekčního procesu:

• děti do 3 let;
• osoby s vrozenou a získanou imunodeficiencí, zejména pacienti v terminálním stadiu infekce HIV (AIDS);
• staří lidé;
• kouření lidí s chronickými respiračními onemocněními;
• lidé s rakovinou, zejména s lézemi hematopoetických orgánů a lymfatického systému;
• pacientů užívajících léky, které potlačují činnost imunitního systému.

Kromě toho jsou k onemocnění náchylnější:

• osoby ze sociálně slabých vrstev obyvatelstva – osoby bez trvalého bydliště, alkoholici, narkomani, vězni apod.;
• lidé žijící ve špatných sociálních a životních podmínkách – vlhké, chladné, neobyvatelné prostory.

Přirozeně se také zvyšuje riziko infekce a rozvoje onemocnění při dlouhodobém častém (neustálém) kontaktu s osobou, která vylučuje patogenní mykobakterie.

Jak mít podezření na aktivní infekční proces způsobený Mycobacterium tuberculosis (MBT)?

Aktivita procesu je charakterizována proliferací patogenního agens v těle. Pomoc při podezření na aktivaci procesu:

1. Klinické projevy:

Zpočátku může proces probíhat bez jasných projevů, ale nejčastěji je aktivní proliferace mykobakterií doprovázena charakteristickými klinickými příznaky. Plicní tuberkulóza je tedy charakterizována dlouhodobým, až několikaměsíčním, zvýšením tělesné teploty na subfebrilní a vyšší hodnoty, prodlouženým, obtěžujícím kašlem (může být doprovázeno hemoptýzou) a zvýšením skupin lymfatických uzlin. Navzdory skutečnosti, že příznaky jsou nespecifické, je při výše uvedených potížích u pacienta nutné provést diagnostická opatření k potvrzení/vyloučení mykobakteriální infekce.

Nezapomínejte, že bakterie mohou postihnout i jiné orgány s příznaky charakteristickým pro jejich poškození, i když v menším procentu případů.

2. Diagnostické metody:

Jako screeningová metoda pro diagnostiku tuberkulózy musí všechny děti ve věku od jednoho roku do 18 let podstoupit každoroční Mantouxův test. Mantoux test je test s tuberkulinem, což je odpadní produkt mykobakterií obsahující proteinové antigeny. Tuberkulin se aplikuje intradermálně, vytvoří se „knoflík“ a po 72 hodinách se vyhodnotí odpověď na diagnostický test. Obvykle po dostatečně dlouhou dobu po očkování bude reakce Mantoux pozitivní a velikost papule by neměla přesáhnout 10 mm. Negativní kožní reakce charakterizuje absenci imunitní odpovědi na podaný lék a lze ji pozorovat u neočkovaných dětí a dospělých, stejně jako po vypršení postvakcinační imunity (často u dětí ve věku 6-7 let, a proto se provádí přeočkování ven). Při velikosti papule větší než 10-15 mm, hnisavých kožních lézích v místě vyšetření, jakož i při kolísavé reakci lze předpokládat rozvoj tuberkulózy a je nutné odeslání k lékaři TBC k vyloučení popř. potvrdit diagnózu. Otočení reakce znamená zvětšení velikosti papule o více než 5 mm oproti jejímu poslednímu měření po předchozím testu Mantoux

Tuberkulínový test Mantoux má vysokou senzitivitu a nízkou specificitu. Je to dáno tím, že k reakci dochází nejen proti mykobakteriím, které mohou způsobit infekci u lidí, ale také proti vakcinačnímu kmeni Mycobacterium bovis. V tomto ohledu existuje vysoké riziko falešně pozitivního výsledku. Tento test však stále zůstává „zlatým standardem“ screeningových opatření, protože s největší pravděpodobností pomáhá identifikovat aktivní proces.

Provedení kožního testu má určité kontraindikace:

• období akutního onemocnění nebo exacerbace chronické;
• kožní onemocnění, exacerbace alergií;
• epilepsie;
• provedení preventivního očkování před méně než 1 měsícem.

Kromě testu Mantoux je pro určité kategorie občanů poskytována další metoda ročního screeningu – plicní radiografie (fluorografie). Mezi tyto kategorie patří učitelé, lékaři, pracovníci mateřských škol a další společensky významné kategorie, ale i lidé žijící v regionu nepříznivém pro tuberkulózu (více než 40 případů na 100 tisíc). Doporučení pro použití radiologických diagnostických opatření pro primární screening jsou uvedena pro všechny dospělé starší 18 let a také pro děti 15 a 17 let, a to nejméně jednou za dva roky. Pokud jsou detekovány alarmující struktury, je pacient odeslán k ftiziatrovi k další diagnostice.

Co dělat dál? Jaké testy se provádějí k diagnostice a potvrzení/vyvrácení podezřelé diagnózy?

Pokud screeningové metody nebo klinické příznaky u osoby, která kontaktuje specialistu na TBC, vyvolávají podezření, že se rozvinul aktivní proces tuberkulózy, jsou k potvrzení diagnózy nutné další testy. V první řadě jsou diagnostické metody zaměřeny na odhalení Kochova bacilu, který onemocnění způsobuje, a posouzení aktivity jeho reprodukce.

V současné době se pro konečnou diagnózu používají následující laboratorní a instrumentální studie:

1. Diaskintest

Diaskintest, stejně jako test Mantoux, je imunologický test. Provádí se jako screeningový test, nebo v případě, kdy Mantoux test ukázal silně pozitivní výsledek, obrat reakce nebo jinou patologickou změnu, která umožnila podezření na tuberkulózu. Výhodou Diaskintestu je, že má vysokou senzitivitu a mnohem větší specificitu. Je to dáno tím, že imunologická reakce na proteinové antigeny se v tomto testu projevuje výhradně ve vztahu k patogenním kmenům skupiny Mycobacterium tuberculosis, které jsou schopny vyvolat tuberkulózu u lidí.

Reakce na test se hodnotí 3. den a normálně by měla být negativní, to znamená, že na kůži nejsou žádné změny kromě stopy po injekci a/nebo malé modřiny v oblasti, kam byl lék podán. Ve všech ostatních případech je nutná další diagnóza a konzultace s odborníkem, protože existuje vysoké riziko aktivního infekčního procesu.

Kontraindikace pro provedení jsou stejné jako u jiných kožních testů.

T-SPOT.TB

2. T-SPOT.TB je test založený na hodnocení produkce gama interferonů T lymfocyty. Jako zkoumaný biologický materiál se používá žilní krev (pravidla pro její darování jsou podobná jako u jiných krevních testů). Samotná reakce probíhá ve zkumavce. Touto výzkumnou metodou se se získanou krví mísí proteinové fragmenty patogenního komplexu mykobakterií a hodnotí se počet T-lymfocytů v krvi, které produkují interferon gama. T buňky reagují v případech, kdy se tělo již s patogenem setkalo a došlo k jeho senzibilizaci. Pozitivní výsledek tedy charakterizuje přítomnost patogenní bakterie v těle, ale neumožňuje nám posoudit aktivitu procesu, protože odpověď bude také na latentní infekci.

Výhody této metody:

• absence falešně pozitivních výsledků a vysoká specificita;
• žádné kontraindikace nebo nežádoucí reakce;
• objektivita metody;

3. Kvantiferonový test

Další diagnostickou metodou je kvantiferonový test. Jeho provedení je shodné s T-SPOT.TB a jediným významným rozdílem je posouzení množství produkovaného interferonu, nikoli stanovení počtu T-lymfocytů.

4. Mikroskopické vyšetření

Studie je informativní pouze u „otevřených“ forem, kdy pacient uvolňuje patogen do prostředí. Pro mikroskopické vyšetření se nejčastěji používá sputum, protože plicní tuberkulóza převažuje nad jinými formami. Pokud je však podezření na jinou lokalizaci, například urogenitální systém, moč a další vzorky. Doporučuje se trojnásobná studie biologického materiálu. Pro vyšetření bakterií pod mikroskopem je nutné přípravek řádně připravit. Používá se Ziehl-Neelsen barvení. K tomu se přípravek zahřívá a natírá jasně karmínovou barvou pomocí fuchsinu. Poté se provede bělení kyselinou a všechny struktury nestabilní vůči kyselinám ztratí svou barvu. Mykobacily přitom zůstávají barevné, protože jsou odolné vůči kyselinám. V poslední fázi jsou zbývající, právě vybělené, prvky natřeny modrou barvou.

Je také možné použít fluorescenční mikroskopii s použitím „osvětlovacích“ barviv.

Metoda je rozšířená díky tomu, že umožňuje spolehlivě určit přítomnost mykobakterií v těle. Hlavním omezením studie je však neschopnost odlišit patogenní kmen způsobující tuberkulózu od jakýchkoli jiných mykobakteriálních bacilů. Kromě toho citlivost závisí na kvantitativním obsahu mikroba v nátěru.

5. Pěstování buněčné kultury

Kultivační metoda je založena na výsevu biologického materiálu na pevná a tekutá diferenciálně diagnostická živná média za účelem růstu mykobakteriálních kolonií. Výsev se provádí na dvě různá média, z nichž jedno je médium Lowenstein-Jensen na bázi vajec. Jak se tvoří kolonie mikroorganismů, hodnotí se rychlost a povaha růstu, barva a další vnější znaky. Molekulární metody a biochemické testy umožňují odlišit bacily způsobující tuberkulózu od netuberkulózních mykobakterií. Během studie je také možné vyhodnotit rezistenci MBT na antituberkulotika.

Pěstování kultury je citlivější technologie než mikroskopické vyšetření, ale vyžaduje podstatně více času a peněz. Růst kolonie mikroorganismu na různých médiích může trvat 12-40 dní až 12 týdnů. Přesto se kultivace na živných půdách spolu s dalšími metodami diagnostiky tuberkulózy používá dodnes.

6. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Metoda molekulární PCR je založena na detekci molekuly genetického materiálu (DNA nebo jejího fragmentu) původce tuberkulózy. Pro polymerázovou řetězovou reakci se používají různé biomateriály (sputum, krev, biopsie, moč nebo mozkomíšní mok) v závislosti na předpokládaném místě rozvoje infekčního procesu. Když se infekce zobecní (typické pro pacienty infikované HIV, ale pozorováno jen zřídka), tyčinky vstupují do krve. Detekce genetického materiálu mikroorganismu indikuje jeho přítomnost v těle a aktivní formu infekce.

7. Radiační metody

Mezi metody radiačního výzkumu patří rentgen, počítačová tomografie (CT), scintigrafie (radioizotop), ultrazvuk (ultrazvuk) a magnetická rezonance (MRI). Jsou pouze pomocné a neumožňují provést spolehlivou diagnózu bez dalších testů. Současně může radiodiagnostika odhalit abnormality ve struktuře plic nebo jiných tkání, což zase pomáhá formulovat správné diagnostické vyhledávání, a pokud je studie provedena po diagnóze potvrzené tuberkulózy, umožňuje posoudit závažnost léze.

8. Testy krve a moči

Testy jsou také pomocné metody a jsou nutné k posouzení stavu, nikoli k diagnostice infekce. Při extrapulmonální tuberkulóze tedy může moč obsahovat stopy bílkovin, velké množství leukocytů a bakterií, které vyžadují vyšetření. Biochemický krevní test může odhalit známky poškození jater, ledvin atd. Mohou být pozorovány změny v koagulogramu.

Žádnou z výše uvedených metod nelze použít samostatně, odděleně od ostatních. Pro stanovení diagnózy tuberkulózy je zapotřebí komplexní vyšetření a soubor diagnostických technik. Pro předepsání testů, registraci a správný výběr lékové terapie je nutná konzultace se specialistou (ftiziatrem).