Gramnegativní bakterie

Gramnegativní bakterie (označené Gram (-)) – bakterie, které se nebarví krystalovou violetí při použití metody Gramova barvení na mikroorganismy [1]. Na rozdíl od grampozitivních bakterií, které si zachovávají fialovou barvu i po umytí odbarvovacím rozpouštědlem (alkoholem), jsou gramnegativní bakterie zcela odbarveny. Po promytí rozpouštědlem se provede Gramovo barvení přidáním kontrastního barviva (obvykle safranin), které barví všechny gramnegativní bakterie do červena nebo růžova. To je způsobeno přítomností vnější membrány, která zabraňuje pronikání barviva do buňky. Samotný test je užitečný při klasifikaci bakterií a jejich rozdělení do dvou skupin na základě struktury jejich buněčné stěny. Díky své silnější a nepropustnější buněčné stěně jsou gramnegativní bakterie odolnější vůči protilátkám než grampozitivní bakterie.

Patogenita gramnegativních bakterií je typicky spojena s určitými složkami jejich buněčných stěn, konkrétně s vrstvou lipopolysacharidů (LPS nebo endotoxická vrstva) [1]. V lidském těle způsobuje LPS imunitní odpověď, která je charakterizována syntézou cytokinů a aktivací imunitního systému. Běžnou odpovědí na syntézu cytokinů je zánět, který může také vést ke zvýšení množství toxických látek v těle hostitele.

Charakteristika [upravit | upravit kód]

Struktura buněčné membrány gramnegativních bakterií

Obecné vlastnosti společné pro většinu gramnegativních bakterií:

1. Přítomnost dvou membrán, mezi kterými je buněčná stěna a periplazmatický prostor.
2. Tenčí vrstva peptidového glykanu ve srovnání s grampozitivními bakteriemi.
3. Vnější membrána obsahuje lipopolysacharidy (skládá se z lipidu A, polysacharidového jádra a antigenu O na vnější straně a fosfolipidů na vnitřní straně).
4. Vnější membrána obsahuje poriny, které fungují jako póry pro určité molekuly.
5. S-vrstva je připojena k vnější membráně, nikoli k vrstvě peptidového glykanu.
6. Pokud existuje bičík, má čtyři podpůrné kroužky, ne dva.
7. Kyselina teichoová a lipoteichoová chybí.
8. Obvykle netvoří spory (výjimkou jsou Coxiella burnetiivytvářející sporovité struktury).
9. Lipoproteiny jsou připojeny přímo k polysacharidovému skeletu.
10. Většina obsahuje lipoprotein Braun, který spojuje vnější membránu a peptidové řetězce kovalentní vazbou.

Chemické složení a struktura buněčných obalů [ editovat | upravit kód]

Níže zkoumáme vrstvy buněčných obalů gramnegativních prokaryot, počínaje nejvnitřnějším:

Buněčná stěna [ upravit | upravit kód]

U gramnegativních eubakterií je struktura buněčné stěny mnohem složitější než u grampozitivních. Obsahuje mnohem větší množství makromolekul různých chemických typů. Peptidoglykan tvoří pouze vnitřní vrstvu buněčné stěny a volně přilne k CPM. U různých typů gramnegativních eubakterií se obsah tohoto heteropolymeru značně liší. U většiny druhů tvoří jedno- nebo dvouvrstvou strukturu, vyznačující se velmi vzácnými příčnými vazbami mezi heteropolymerními řetězci.

Některé posuvné bakterie (myxobakterie, flexibakterie) jsou schopny při pohybu po pevném substrátu periodicky měnit tvar svých buněk, například ohýbáním, což svědčí o elasticitě jejich buněčné stěny a především její peptidové glykanové vrstvy. Elektronové mikroskopické vyšetření však odhalilo, že mají buněčnou stěnu typickou pro gramnegativní eubakterie. Nejpravděpodobnějším vysvětlením flexibility buněčné stěny těchto bakterií je extrémně nízké zesíťování jejich peptidové glykanové složky [2].

Periplazmatický prostor [ upravit | upravit kód]

Objevení se další membrány v buněčné stěně gramnegativních eubakterií ve skutečnosti vedlo k vytvoření samostatné dutiny (periplazmatického prostoru), oddělené od cytoplazmy a vnějšího prostředí specifickými membránami a nesoucí důležitou funkční zátěž [2].

Periplazmatický prostor, kde je ponořena vrstva peptidového glykanu, je vyplněn roztokem obsahujícím specifické proteiny, oligosacharidy a anorganické molekuly. Periplazmatické proteiny jsou reprezentovány dvěma typy: transportními proteiny a hydrolytickými enzymy.

Bylo také objeveno, že mnoho bakterií je schopno produkovat velké množství enzymů (glykosidázy, proteázy, lipázy atd.), které hydrolyzují všechny typy molekul polymerů. Posledně jmenované mohou být buď molekuly syntetizované buňkou samotnou, nebo cizí, které do buňky vstupují zvenčí. Negativní důsledky hydrolýzy vlastních molekul (samotrávení) jsou zřejmé. Prokaryota přitom hydrolytické enzymy potřebují, protože se tak rozšiřuje okruh látek, které používají, včetně polymerů různých typů. Potřeba izolovat tyto enzymy z cytoplazmatického obsahu je jasná. Grampozitivní eubakterie vylučují hydrolytické enzymy do vnějšího prostředí u gramnegativních bakterií jsou lokalizovány v periplazmatickém prostoru.

Vnější membrána [ upravit | upravit kód]

Mimo peptidoglykan existuje další vrstva buněčné stěny – vnější membrána. Skládá se z fosfolipidů typických pro elementární membrány, proteinů, lipoproteinů a lipopolysacharidů. Specifickou složkou vnější membrány je lipopolysacharid komplexní molekulární struktury, zabírající asi 30-40 % jejího povrchu a lokalizovaný ve vnější vrstvě.

Proteiny vnější membrány lze rozdělit na hlavní a vedlejší. Esenciální proteiny jsou zastoupeny malým počtem různých typů, ale tvoří téměř 80 % všech proteinů vnější membrány. Jednou z funkcí těchto proteinů je tvorba hydrofilních pórů v membráně o průměru přibližně 1–15 nm a délce 50–70 nm, skloněných k povrchu buněčné stěny pod úhlem 30–40° . Prostřednictvím nich dochází k nespecifické difúzi molekul o hmotnosti až 600–900 Da. To znamená, že přes takové póry mohou procházet cukry, aminokyseliny, malé oligosacharidy a peptidy. Proteiny, které pronikají vnější membránou a tvoří hydrofilní póry, se nazývají poriny. Vedlejší proteiny vnější membrány jsou zastoupeny mnohem větším počtem typů. Jejich hlavní funkcí je transport a receptor. Příkladem minoritních proteinů jsou proteiny odpovědné za specifický transport sloučenin obsahujících železo do buňky.

Různé funkce plní makromolekuly lokalizované částečně nebo úplně na vnější straně buněčné stěny v kontaktu s prostředím; Jedná se o specifické receptory pro fágy a koliciny; antigeny; makromolekuly, které zajišťují mezibuněčné interakce během konjugace, stejně jako mezi patogenními bakteriemi a tkáněmi vyšších organismů.

S-vrstva a oscilinové fibrily [ upravit | upravit kód]

Hlavní článek: Vrah

S-vrstva popř zubaté vrstvy — vrstva těsně zabalených proteinů, která lemuje vnější povrch buňky a poskytuje ochranu před náhlými změnami pH nebo koncentrací jakýchkoli iontů. Nad touto vrstvou je vrstva vlasu podobných fibril, umístěná mimo vnější membránu sinic, schopná klouzání. Vlasovité fibrily horní vrstvy jsou složeny z tyčinkovitého glykoproteinu zvaného oscillin.

Ke skluzu dochází sekrecí hlenu přes póry na vnější stranu buněčných membrán [3]. Hlen prochází po povrchu oscilačních fibril vnější vrstvy buňky a podél přilehlého substrátu a tlačí fibrily dopředu. Agregát organizovaných vlasových fibril tak působí jako pasivní vrtule, zatímco hlen prochází po jejich povrchu klouzavým procesem [4].

Klasifikace [upravit | upravit kód]

Spolu s analýzou tvaru buněk je Gramovo barvení rychlou diagnostickou metodou, která se dříve používala k seskupování bakteriálních druhů do pododdílů.

Lékařská hierarchie druhů

Na základě Gramova barvení bylo nyní zaniklé království Monera rozděleno do čtyř divizí: Firmacutes (+), Gracillicutes (-), Mollicutes (0) a Mendocutes (var.) [5] . Počínaje rokem 1987 však byla monofylie gramnegativních bakterií zpochybňována a později zcela vyvrácena bimolekulárními studiemi [6]. Někteří autoři, např. T. Cavalier-Smith, je však stále považují za monofyletický klad a přiřazují je k subříši Negibakterie [7].

Struktura vnější buněčné membrány a klasifikace bakterií [ editovat | upravit kód]

Je důležité zdůraznit, že ačkoli se bakterie tradičně rozdělují do dvou hlavních skupin, grampozitivní a gramnegativní, je tato klasifikace nejednoznačná a svévolná, protože může odkazovat na tři zcela odlišné aspekty (výsledek barvení, organizace buněčných membrán, taxonomická skupina), které se nemusí nutně shodovat pro všechny typy bakterií [8] [9] [10] [11] . Reakce na barvení grampozitivních a gramnegativních bakterií není spolehlivou charakteristikou také proto, že tyto dva typy bakterií netvoří fylogeneticky jedinou skupinu [8]. Nicméně, ačkoli Gramovo barvení je empirickým kritériem, je založeno na zřetelných rozdílech v ultrastruktuře a chemickém složení dvou hlavních typů prokaryotických buněčných stěn nalezených v přírodě. Oba tyto typy buněčných stěn se od sebe liší přítomností nebo nepřítomností vnější lipidové membrány, což je spolehlivější a základní charakteristika bakteriálních buněk [8] [12]. Všechny grampozitivní bakterie jsou obklopeny jednou vrstvou fosfolipidové membrány a obvykle mají silnou vrstvu (20–80 nm) peptidových glykanů (murein atd.), která zadržuje Gramovo barvení. Blízko je i řada dalších bakterií, obklopených jedinou membránou, ale barvící se gramnegativní kvůli absenci peptidové glykanové vrstvy (viz mykoplazmata) nebo jejich neschopnosti udržet Gramovo barvení kvůli specifickému složení buněčné stěny. související s grampozitivními bakteriemi. Pro bakteriální buňky obklopené jedinou buněčnou membránou, termín monodermální bakterie nebo monodermická prokaryota [8] [8] [12] . Na rozdíl od grampozitivních bakterií jsou všechny archetypální gramnegativní bakterie kromě cytoplazmatické membrány obklopeny také vnější buněčnou membránou a obsahují mezi sebou extrémně tenkou vrstvu peptidových glykanů (2-3 nm). Přítomnost vnitřních a vnějších membrán dává vzniknout novému buněčnému kompartmentu – periplazmatickému prostoru. Takové bakterie/prokaryota byly označeny jako bakterie diderm [8] [8] [12] .

Dalším důležitým rozdílem mezi monodermickými a didermickými prokaryoty je konzervativní soubor delecí v řadě důležitých proteinů (viz DnaK, GroEL) [8] [9] [12] [13]. Ze dvou strukturně odlišných skupin prokaryotických organismů jsou monodermy považovány za skupinu předků didermů. Na základě řady pozorování, včetně skutečnosti, že grampozitivní bakterie jsou většinou producenty antibiotik a gramnegativní bakterie jsou vůči nim obvykle rezistentní, bylo navrženo, že vnější buněčná membrána gramnegativních bakterií má ochranný mechanismus proti selektivní působení antibiotik [8] [9] [12] [13] . Některé bakterie, jako např Deinokok, barví se grampozitivně díky silné vrstvě peptidového glykanu, ale mají vnější buněčnou membránu a jsou považovány za meziprodukty mezi monodermy (grampozitivní) a didermy (gramnegativní) [8] [13]. Bakterie didermu lze dále rozdělit na jednoduché didermykteré nemají lipopolysacharidovou vrstvu, archetypální didermy, jehož vnější buněčná membrána obsahuje lipopolysacharidy, a vlastně diderm, jehož vnější membránu tvoří kyselina mykolová [10] [11] [13] [14] .

Kromě toho mnoho bakteriálních taxonů (viz Zápory, Fusobakterie, Synergisté и Elusimikrobie), které jsou součástí typu Firmicutes nebo její blízce příbuzná větev, mají také didermickou buněčnou strukturu [11] [13] [14] . Konzervativní delece (CSI) v proteinu HSP60 (GroEL) však slouží jako charakteristický znak všech tradičních typů gramnegativních bakterií (tj. Proteobakterie, Aquificae, Chlamydie, Bacteroidetes, Chlorobi, Cyanobacteria, Fibrobacteres, Verrucomicrobia, Planctomycetes, Spirochety, Acidobacteria atd.) z atypických didermů a dalších typů monodermálních bakterií (jako např Actinobacteria, Firmicutes, Thermotogae, Chloroflexi atd.) [13] . Přítomnost CSI ve všech sekvenovaných druzích z běžného kmene gramnegativních bakterií obsahujících LPS poskytuje důkaz, že tento kmen bakterií tvoří monofyletický klad a naznačuje, že žádný druh v této skupině nezaznamenal ztrátu vnější membrány. Tyto údaje hovoří proti hypotéze původu monodermických prokaryot z didermických prostřednictvím ztráty vnější membrány [13].

Příklady druhů [ editovat | upravit kód]

Proteobakterie jsou velkou skupinou gramnegativních bakterií, které zahrnují Escherichia coli (E. coli), Salmonella, Shigella a další Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, bakterie kyseliny octové, Legionella a mnoho dalších. Mezi další významné skupiny gramnegativních bakterií patří sinice, spirochety, zelené sírové a nesirné bakterie.

Řada gramnegativních bakterií je spojena s nozokomiálními infekcemi. Mezi nimi Acinetobacter baumannii, způsobující bakteriémii, sekundární meningitidu a ventilátorovou pneumonii u pacientů na jednotkách intenzivní péče.

Lékařský význam [ editovat | upravit kód]

Jednou z několika jedinečných vlastností gramnegativních bakterií je struktura jejich vnější buněčné membrány. Vnější vrstva membrány obsahuje komplex lipopolysacharidů, jejichž lipidové části působí jako endotoxiny. Pokud se endotoxiny dostanou do transportního systému, dochází k intoxikaci s následným zvýšením teploty, zvýšenou dechovou frekvencí a snížením krevního tlaku. To vše může vést k toxickému šoku a následné smrti.

Vnější membrána chrání bakterie před některými antibiotiky, barvivy a detergenty, které by za normálních okolností poškodily vnitřní membránu nebo buněčnou stěnu. Tato ochrana činí bakterii odolnou vůči lysozymu a penicilinu. Byly však vyvinuty alternativní způsoby léčby, jako je EDTA lysozym a antibiotikum ampicilin, které mohou proniknout ochrannou vnější membránou některých patogenních gramnegativních organismů. Ke stejnému účelu lze použít i jiné léky, z nichž nejúčinnější jsou chloramfenikol, streptomycin a kyselina nalidixová.

Viz také [upravit | upravit kód]

• Brownův lipoprotein
• Gramovo barvení

Zdroje[upravit | upravit kód]

1. ↑ 123 »Salton MRJ, Kim KS. Struktura.in: Baronova lékařská mikrobiologie (Baron S. et al., eds.). — 4. — Univ of Texas Medical Branch, 1996. — ISBN 0-9631172-1-1. Archivováno 9. února 2009 na Wayback Machine
2. ↑ 12Gusev M.V., Mineeva L.A. Mikrobiologie: Učebnice. — 2003. − 464 s.
3. ↑ (Hoiczyk a Baumeister, 1998; Hoiczyk, 2000)
4. ↑Lee RE Fykologie. — 4. vyd. — Colorado State University, USA.
5. ↑Gibbons, N. E.; Murray, R.G.E. Návrhy týkající se vyšší daňové sazby bakterií (angl.) // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology : journal. — 1978. — Sv. 28, č. 1. — S. 1—6 . — doi:10.1099/00207713-28-1-1.
6. ↑Woese ČRBakteriální evoluce.(angl.) // Mikrobiologické recenze. — 1987. — Sv. 51, č.p. 2. — S. 221—271. — PMID 2439888. [ ↑Cavalier-Smith T.Zakořenění stromu života pomocí přechodových analýz(angl.) // Biology Direct: časopis. — 2006. — Sv. 1. — S. 19 . — doi:10.1186/1745-6150-1-19. — PMID 16834776. — PMC1586193. Archivováno z originálu 18. prosince 2019.
7. ↑ 12345678910Gupta RS (1998) Proteinové fylogeneze a podpisové sekvence: Přehodnocení evolučních vztahů mezi archaebakteriemi, eubakteriemi a eukaryoty. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 1435–1491.
8. ↑ 123Gupta RS (2000) Přirozené evoluční vztahy mezi prokaryoty. Crit. Rev. Microbiol. 26: 111–131.
9. ↑ 12Hrají Desvaux Mickaël, Hébraud Michel, Talon Régine, Henderson Ian R.Sekrece a subcelulární lokalizace bakteriálních proteinů: problém sémantického povědomí // Trendy v mikrobiologii. — 2009. — Duben (roč. 17, č. 4). — S. 139—145 . — ISSN0966-842X. — doi:10.1016/j.tim.2009.01.004. [opravit]
10. ↑ 123Sutcliffe Iain C.Pohled na architekturu obalu bakteriální buňky na úrovni kmene // Trendy v mikrobiologii. — 2010. — Říjen (roč. 18, č. 10). — S. 464—470 . — ISSN0966-842X. — doi:10.1016/j.tim.2010.06.005. [opravit]
11. ↑ 12345Gupta RS (1998). Co jsou archaebakterie: třetí doména života nebo monodermální prokaryota příbuzná grampozitivním bakteriím? Nový návrh klasifikace prokaryotických organismů. Molekulární mikrobiologie. 29(3):695-707.
12. ↑ 1234567Gupta RS (2011). Původ didermových (Gram-negativních) bakterií: antibiotický selekční tlak spíše než endosymbióza pravděpodobně vedl k evoluci bakteriálních buněk se dvěma membránami. Antonie van Leeuwenhoek. 100:171–182.
13. ↑ 12Marchandin H., Teyssier C., Campos J., Jean-Pierre H., Roger F., Gay B., Carlier JP, Jumas-Bilak E.Negativicoccus succinicivorans gen. nov., sp. nov., izolované z lidských klinických vzorků, poskytly popis čeledi Veillonellaceae a popis Negativicutes classis nov., Selenomonadales ord. listopad. a Acidaminococcaceae fam. listopad. v bakteriálním kmeni Firmicutes.(angl.) // Mezinárodní časopis systematické a evoluční mikrobiologie. — 2010. — Sv. 60, č. Pt 6. — S. 1271—1279. — doi:10.1099/ijs.0.013102-0. — PMID 19667386.[

Odkazy na externí zdroje

Slovníky a encyklopedie

• Velká Katalánština
• Britannica (online)

Vědcům z University of Illinois se poprvé po padesáti letech podařilo vytvořit sloučeninu, která poslouží jako základ pro novou řadu antibiotik proti gramnegativním bakteriím. Klíčovými parametry takové molekuly byly její velikost, globularita, určitá rovnováha polárních a hydrofobních charakteristik a přítomnost rotující aminové skupiny, která jí umožňuje účinně pronikat do buňky poriny. Sloučenina na bázi dioxynibomycinu prokázala svou účinnost proti širokému spektru gramnegativních bakterií. Studie byla zveřejněna v Příroda.

Gramnegativní bakterie, na rozdíl od grampozitivních bakterií, mají dvě buněčné membrány. Vnější membrána obsahuje hodně lipopolysacharidů a kvůli tomu je přístup mnoha látek do buňky obtížný. Pro boj s touto skupinou organismů je k dispozici mnohem méně antibiotik ve srovnání s léky proti grampozitivním bakteriím. Poslední skupina takových antibiotik byla objevena v roce 1968. Jde o aromatické sloučeniny zvané chinolony a do buňky gramnegativní bakterie jsou schopny pronikat speciálními proteinovými komplexy vnější membrány – poriny, kterými bakterie přijímá látky potřebné pro své životní funkce. Uvnitř buňky blokují mechanismy replikace DNA a bakterie umírají.

Patogenní bakterie se mohou stát rezistentními vůči antibiotikům, proto se neustále vyvíjejí nové léky pro boj s nimi. V roce 2007 analyzoval Farmakologický projekt GlaxoSmithKline pět set tisíc kandidátů na nové antibiotikum pro gramnegativní bakterie, ale práce byla neúspěšná.

V tomto projektu vědci vybrali sto sloučenin s potenciálním antibiotickým účinkem. Výchozím materiálem pro vývoj nových sloučenin byly molekuly, které se díky svým prostorovým parametrům mohly dostat do bakteriální buňky a měly antibiotické vlastnosti. V tomto případě byly vybrány ty z nich, které lze bez vážnějších problémů podrobit různým chemickým přeměnám, což umožňuje mírnou úpravu jejich polarity, prostorových charakteristik a dalších parametrů.

Antibiotikum, které působí na gramnegativní bakterie, musí pory za prvé projít, to znamená být jimi „rozpoznáno“, a za druhé musí mít dostatečně tuhou strukturu a nízkou globularitu – tedy vyznačovat se určitou kompaktnost, aby se tam nezasekly. Předchozí práce ukázaly, že sloučenina, která může procházet poriny, musí být vysoce polární a mít hmotnost menší než 600 Da. Navíc se musí rychle akumulovat v buňce, protože gradientní pumpy ho odtamtud odčerpávají a rychlost jeho vstupu musí převyšovat rychlost odčerpávání.

Počítačové modelování prostorové struktury sloučenin a následné laboratorní testování umožnilo sestavit seznam nezbytných kritérií potřebných k tomu, aby taková látka úspěšně pronikla do buňky. Ukázalo se, že nejúčinněji se v buňce hromadí sloučeniny, které mají pět nebo méně rotujících vazeb, jejichž koeficient globularity je 0,25 nebo méně, a navíc kromě polárních charakteristik musí mít určitou hydrofobnost a mít stericky volná (nefixovaná) aminová skupina.

Jako základ byla proto zvolena sloučenina dioxynibomycin (DNM), která inhibuje DNA gyrázu grampozitivních bakterií, ale nemá žádný vliv na gramnegativní druhy. Poprvé byl vyvinut tam, na University of Illinois, ale v roce 1960. Jeho koeficient globularity je 0,02 a nemá žádné rotační vazby. Jeho analog, který má šestičlenný kruh místo pětičlenného (6DNM), byl upraven přidáním aminoskupiny (6DNM-NH3). Výsledná sloučenina měla antibakteriální aktivitu, účinně ničila téměř všechny gramnegativní bakterie použité v experimentu, včetně patogenního kmene, který byl extrémně odolný vůči antibiotikům. Escherichia coli ATCC BAA-2469 (výjimkou byl druh Pseudomonas aeruginosa, který je také téměř necitlivý na antibiotika).

O obtížích, s nimiž se výzkumníci potýkají při vývoji antibakteriálních léků, jsme již hodně psali. Parametry vybrané vědci pro 6DNM-NH3 by mohly sloužit jako základ pro vývoj nové řady antibiotik potřebných pro boj s řadou bakteriálních onemocnění. Vědci poznamenávají, že v předchozích projektech, navzdory obrovskému počtu různých sloučenin navržených jako kandidátní antibiotika pro gramnegativní bakterie, neexistovaly žádné molekuly, které by kombinovaly všechny vlastnosti objevené v této studii, které jsou nezbytné pro účinný průchod látky poriny. a akumulaci uvnitř buňky.